1　HPLC分析の概念/ HPLC分析的概念

HPLCとはHigh Performance Liquid Chromatographyの略で、日本語では高速液體クロマトグラフと呼びます。なお、クロマトグラフィーは測定方法、クロマトグラムは測定結果、クロマトグラフは裝置を指します。Tswettの実験で使用したオープンカラムは、技術の発展によって専用のカラムが開発されました。一定の速度でカラムに液體を送液するポンプも開発され、一つの分析システムとして高性能化したことで、High Performance Liquid Chromatography（HPLC）と表記されるようになりました。簡単にはLCと記載されることもあります。現在は、さらに高性能化が進み、高速分析が可能になったUltra high performance liquid chromatography（UHPLC）も用いられています。HPLCの分析対象は液體中に溶解している成分です。液體試料に溶解している化合物を分離し、どのような成分がどれくらい含まれているかを定性?定量分析することができます。図1に、HPLCの概念を示します。HPLCの分析で、液體試料內の成分を分離のために流す液體を移動相と呼びます。移動相は送液ポンプにより、カラム（固定相）から検出器へ一定速度で流れていきます。複數の成分が混合した試料をカラムに注入し、カラム內で分離します。カラム出口に設置した検出器でモニターし、成分を定性?定量分析します。

HPLC是High Performance Liquid Chromatography的縮寫，日語中稱為高速液相色譜儀。注意，色譜是指測定方法，色譜圖是指測定結果，色譜儀是指設備。隨著技術的進步，Tswett 實驗中使用的開放式柱已被專用柱所取代。還開發了一種泵，用于以恒定的速度將液體輸送到色譜柱，并且系統的性能得到提高，直到被稱為高效液相色譜法 (HPLC)。有時也簡稱為 LC。目前正在使用的超高效液相色譜法 (UHPLC) 更加復雜，可以進行高速分析。 HPLC 的分析對象是溶解在液體中的成分。可以分離溶解在液體樣本中的化合物，并進行定性和定量分析，以確定存在哪些成分以及含量。圖 1 顯示了 HPLC 的概念。在 HPLC 分析中，承載液體樣品中成分并將其分離的液體稱為流動相。流動相通過泵以恒定的速率從色譜柱（固定相）流到檢測器。將含有多種成分混合物的樣品注入柱中，然后在柱中分離。使用安裝在塔出口的檢測器監測各組分，并進行定性和定量分析。

2　HPLCの裝置構成/ HPLC設備配置

HPLCの概念（図1）ではHPLCの仕組みを模式図的に示しましたが、実際のHPLCは、送液ポンプ、脫気裝置、試料導入裝置、カラムオーブン、検出器およびデータ処理裝置といった様々なコンポーネントで構成されています。図2にHPLCの裝置構成の概略および各コンポーネントの役割を示します。

HPLC 概念（圖 1）顯示了 HPLC 的工作原理示意圖，但實際的 HPLC 需要各種組件，例如液體輸送泵、脫氣器、進樣裝置、柱溫箱、檢測器和數據處理設備。它由以下組件組成：圖 2 顯示了 HPLC 系統配置概述以及各個組件的作用。

HPLCでは送液ポンプを用い、移動相を一定流量で送液します（a）。我々が生活している大気圧の條件下は移動相に気體が混入（溶存）しやすい環境です。気體が溶存した移動相を送液ポンプが吸引すると気泡が発生し、流量変動やベースラインのノイズ/ドリフトなどのトラブルが生じます。トラブルを防ぐため、送液ポンプの上流には脫気裝置を設置します(b)。 溶存気體が除去された移動相はカラムに送液され、試料導入裝置でカラムに導入します(c)。カラムでの成分分離は周囲の溫度変化の影響を受けます。周囲の溫度環境を一定にするため、カラムはカラムオーブン內で溫調します(d)。カラムから溶出した成分は、カラム出口に設置した検出器でモニターします(e)。データ処理裝置は、検出器から送られてくる信號を処理して、クロマトグラムを出力し、定性、定量のためのデータ処理を行います(f)。このような流れでHPLC分析の結果が得られます。

在 HPLC 中，使用泵以恒定流速 (a) 輸送流動相。我們生活的大氣壓條件是氣體很容易混合（溶解）在流動相中的環境。當泵吸入含有溶解氣體的流動相時，就會產生氣泡，從而引起流速波動和基線噪聲/漂移等問題。為了防止出現問題，在液體輸送泵（b）的上游安裝了一個脫氣裝置。除去了溶解氣體的流動相被送至色譜柱，并通過進樣裝置（c）引入色譜柱中。塔中的組分分離受周圍溫度變化的影響。為了保持恒定的環境溫度，將柱子放入柱溫箱 (d) 中加熱。從色譜柱洗脫出的組分由安裝在色譜柱出口 (e) 處的檢測器監測。數據處理單元對檢測器送來的信號進行處理，輸出色譜圖，并進行定性和定量分析的數據處理（f）。這就是獲得HPLC分析結果的方法。

3　HPLCにおける分離メカニズム/ HPLC 的分離機理

HPLCの使用により、さまざまな成分が分離できるのは、各成分がカラム內を移動する速度が異なるためです。図3にHPLCにおける分離のメカニズムを示します。カラムの中では成分と移動相との相互作用（引き合う力）が強ければ、その成分は移動相の流れに乗ってカラムの中を速く移動し、早く溶出します。一方、固定相との相互作用が強ければ、移動相の流れに乗りにくいためカラムの中をゆっくり移動します。図3では、黃色の成分が移動相との相互作用が強く、早く分離?溶出され、ピンクの成分が固定相との相互作用が強く、遅く分離?溶出される、の例を示しています。このように、カラムの中を進む各成分の速度の違いがHPLCにおける分離のメカニズムです。

使用 HPLC，可以分離不同的成分，因為每種成分以不同的速率通過色譜柱。圖3顯示了HPLC的分離機制。如果色譜柱內某種組分與流動相之間的相互作用（吸引力）強，那么該組分就會隨著流動相的流動而更快地流過色譜柱，從而更快地被洗脫出來。另一方面，如果與固定相的相互作用很強，它將不容易被流動相攜帶并會緩慢地穿過色譜柱。圖3所示的例子中，黃色組分與流動相相互作用強，較早分離和洗脫，而粉色組分與固定相相互作用強，較晚分離和洗脫。這樣，各個組分通過色譜柱的速度差異就是 HPLC 分離的機制。

4　クロマトグラムの読み方/4. 如何讀色譜圖

HPLCによる分離の結果を示すグラフをクロマトグラムといいます。図4にクロマトグラムの読み方を示します。カラムから何も溶出しないときには時間軸（橫軸）と平行な直線が描かれます。これをベースラインと言います。カラムの中で相互作用をした成分が溶出すると、ベースラインの上に山のような盛り上がりが現れます。これがピークです。カラムに成分が留まることを保持と呼び、分析のスタート（試料をカラムに注入）からピーク頂點までの時間を保持時間（tR）といいます。カラム內で固定相と相互作用せず、カラムを素通りした時間を非保持の時間（t0）といいます。ピークの頂點から垂線を引いた時の距離をピーク高さ（h）、水色に塗りつぶされた部分の面積をピーク面積（A）といいます。これらの結果を用いて、試料成分の定性および定量に用います。

顯示 HPLC 分離結果的圖表稱為色譜圖。圖4顯示了如何讀取色譜圖。當沒有任何東西從柱中洗脫出來時，會畫一條與時間軸（橫軸）平行的直線。這被稱為基線。當與色譜柱相互作用的組分被洗脫時，基線上方就會出現山狀凸起。此為巔峰。組分在色譜柱中的保留時間稱為保留時間，從分析開始（將樣品注入色譜柱）到峰頂點的時間稱為保留時間（tR）。物質通過色譜柱而不與色譜柱內固定相發生相互作用的時間稱為非保留時間（t0）。從峰頂點引一條垂直線時的距離稱為峰高（h），淡藍色部分的面積稱為峰面積（A）。這些結果用于定性和量化樣品成分。